PRÁCTICA No.4.
"SUBCULTIVO. (SIEMBRA DE
MATERIAL YA ESTABLECIDO IN - VITRO)"
QUIENES PRESENTAN:
Luis Antonio Flores Hernández
Flor del Carmen Dorantes Nava
Deyanira Vergara Pérez
Fanny Imelda PastenesFelizola
Zulai
Espinoza Avianeda
Luz Eugenia Ruíz Nagera
LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
Ciudad Altamirano, Gro. México. 23 de Marzo del 2012
“SUBCULTIVO.
(SIEMBRA DE MATERIAL YA ESTABLECIDO IN - VITRO)”
1Dorantes N.F.C., 1Espinoza
A.Z., 1Flores H.L.A., 1Pastenes F. F. I. 1 Vergara P.D. 1Ruiz
N.L.E
1Instituto Tecnológico de Cd.
Altamirano
RESUMEN
El
cultivo de tejido vegetal se ha convertido en una herramienta importante en la
selección, cruzamiento, control de enfermedades y producción en masa de
cultivos de cosecha e involucra diferentes plantas en agricultura,
horticultura, forestales y frutales. Por esta razón la presente practica tuvo
como objetivo sembrar explantes de Manihotesculentacon el
fin de aprender como sembrar los tejido vegetal y hacer buen uso del mismo
dentro de la campana de flujo. Primero se tiene que esterilizar la campana con
alcohol al 70%, posteriormente introducir el todo el material que se utilizara
después de esto esterilizar los explantes, cortarlos y sembrarlos en el medio
de cultivo. Todo esto son una absoluta limpieza y orden durante toda la
práctica. Se obtuvo un porcentaje de contaminación de un 0% y un 100% de
sobrevivencia, esto gracias al trabajo del equipo y por la absoluta asepsia que
hubo al momento de sembrar los explantes, uno de los factores mas importantes
para sembrar tejido vegetal in vitro es la asepsia con la que se realiza la
siembra ya que esta determina el grado de contaminación del tejido vegetal ya
cultivado. La práctica tuvo éxito ya que se consiguió un porcentaje de
contaminación del 0% así como se aprendió a manejar el tejido vegetal dentro de
la campana de flujo.
SUBCULTURE.
(PLANTING MATERIAL AND ESTABLISHED IN - VITRO) "
1Dorantes N.F.C., 1Espinoza
A.Z., 1Flores H.L.A., 1Pastenes F. F. I. 1 Vergara P.D. 1Ruiz
N.L.E
1Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano
ABSTRACT
The plant tissue culture has become an important tool
in the selection, breeding, disease control and mass production of cash crops
and involves different plants in agriculture, horticulture, forestry and
orchards. For this reason this practice was aimed at sowing Manihotesculenta explants in order to
learn how to grow the plant tissue and make good use of it within the flow
hood. First have to sterilize the hood with 70% alcohol, then introducing the
material to be used thereafter sterilized explants, cutting and planting them in
the culture medium. This is an absolute cleanliness and order throughout the
practice. We obtained a contamination rate of 0% and 100% survival, this thanks
to the team and the absolute asepsis that was planted when the explants, one of
the most important factors to grow in vitro plant tissue is asepsis with the
planting is done because this determines the degree of contamination of plant
tissue and cultured. The practice was successful as was achieved contamination
percentage of 0% and is learned to operate the plant tissue within the flow
hood.
Keywords: plant tissue explant asepsis, flow hood,
contamination.
I ANTECEDENTES
De acuerdo a Fossard los explantes son de diversa
naturaleza, pueden ser porciones de tejido, células sueltas, protoplastos,
esporas, granos de polen o semillas. Por otro lado el tipo de explante a usarse
en los procesos de micropropagación depende de la especie con la que se esté
trabajando y de los objetivos que se persigan. Los explantes como los
meristemos apicales y las yemas axilares son genéticamente muy estables, este
tipo de explantes sirve para reproducir múltiples clones de una forma o
variedad con características especiales que se desea mantener en el cultivo (Fossard
1999)
Otros
explantes como las yemas adventicias son más bien genéticamente inestables y
producen un alto grado de variabilidad en los clones, este procedimiento no es
útil para la producción de plántulas con una determinada característica de
cultivo, pero sí lo es para el fitomejoramiento, ya que mediante esta variación
semi–natural, es posible obtener nuevas líneas de cultivo.
Una vez que se ha obtenido el explante, este debe ser correctamente desinfectado para evitar la proliferación de contaminantes biológicos (bacterias, hongos y levaduras principalmente) en el medio, los cuales afectan el crecimiento y desarrollo del explante (Fontúrbel 2001) y compiten con el mismo deteriorándolo y haciéndolo inservible para cultivo (Kyte&Kleyn 1996).
Una vez que se ha obtenido el explante, este debe ser correctamente desinfectado para evitar la proliferación de contaminantes biológicos (bacterias, hongos y levaduras principalmente) en el medio, los cuales afectan el crecimiento y desarrollo del explante (Fontúrbel 2001) y compiten con el mismo deteriorándolo y haciéndolo inservible para cultivo (Kyte&Kleyn 1996).
Los explantes desinfectados son trasladados a una cámara de flujo laminar (con aire filtrado, libre de microorganismos) donde se realizará la transferencia a un medio de cultivo apropiado al tipo de especie y las necesidades del cultivo. Una vez que el explante está en el medio, se sella el rasco de cultivo y se traslada a una cámara de crecimiento con condiciones de humedad, temperatura y fotoperiodo controladas para su desarrollo(Kyte&Kleyn 1996).
Una vez que los explantes –luego de algunas semanas en la cámara de crecimiento– han desarrollado algunas raíces y hojas, es el momento de realizar el traspaso al invernadero. Este es uno de los pasos más difíciles de la técnica, ya que los explantesin vitro se encuentran en condiciones ambientales muy diferentes y se alimentan de manera heterotrófica (del medio de cultivo) y el estrés de adaptación a las condiciones de vivero es muy fuerte. Un porcentaje de las plántulas clonadas in vitro no sobrevive al invernadero, pero la parte que si sobrevive crece –ya en condiciones normales– y al cabo de unas semanas está lista para ser trasladada al campo de cultivo (Kyte&Kleyn 1996, Fossard 1999).
II
DEFINICIÓN DEL PROBLEMA
En la actualidad existen varios problemas en los diferentes
cultivos de plantas (plagas de insectos, hongos, bacterias, et.). Para una mejor
producción se requiere de condiciones específicas para su optimo desarrollo, es
por ello que es necesario realizar los cultivos in vitro.
III.
OBJETIVOS
·
Conocer
el manejo apropiado del material vegetal en cámara de flujo
·
Asimilar
las habilidades en la siembra del material vegetal.
IV JUSTIFICACIÓN
Los cultivos in vitro son la mejor opción para el cultivo de
plantas puesto que tiene los requerimientos necesarios para su optimo
desarrollo. Además la clave para el mejor desarrollo de esta es el buen manejo
de siembra ya que es por el buen manejo que se los tienen resultados que se
pretenden optener.
V. FUNDAMENTO TEÓRICO
Las
plantaciones forestales tienen una función creciente en el abastecimiento
futuro de la industria forestal mundial y liberan presión sobre el uso maderero
de los bosques naturales. Al respecto, Sedjo (1997) destacó el aporte de las
innovaciones en genética y biotecnología para obtener árboles de buen
crecimiento y con características deseadas. Sin embargo, la concentración de la
producción industrial en plantaciones forestales con unas pocas especies
plantea el desafío de la diversificación con nuevas especies para asegurar una
producción forestal sostenible.
Entre las
especies con potencialidad de uso comercial por su rápido crecimiento y calidad
y uso de la madera está el raulí, Nothofagus alpina (Nothofagus procera (Poepp.
et Endl.)Árbol endémico de los bosques subantárticos de Chile y Argentina,
crece en las laderas de las montañas, a altitudes intermedias entre 300–1 200
m, en suelos profundos con buen drenaje (Hoffmann, 1982). Sin embargo, los
niveles de producción de semillas tienen fluctuaciones anuales que corresponden
a patrones cíclicos de variación en la especie (Gutiérrez, 2000; Ipinza y
Espejo, 2000). Para aumentar la productividad del recurso y obtener un
beneficio sostenible, se enfatiza la aplicación de herramientas de mejoramiento
genético junto con técnicas biotecnológicas y silvícolas en la propagación de
esta especie. Las estrategias de mejoramiento de especies forestales incorporan
técnicas de propagación asexual como la macropropagación (mediante injerto y
estaca) y la micropropagación que permiten transferir toda la varianza genética
a los descendientes, duplicando la ganancia genética asociada a los esquemas
sexuales de propagación (Ikemori et al., 1994).
En
especies de Nothofagusla organogénesis directa se inicia con trozos de
tejidos, yemas, secciones nodales y axilares obtenidos de plantas juveniles y
adultas y se ha definido el estadio óptimo de los brotes y yemas a propagar la
embriogénesis somática utiliza semillas como explante inicial (Castellanos et
al., 2005). En el cultivo de estos tejidos se emplean los medios nutritivos
Broadleaved Tree Medium (BTM), Murashige y Skoog (MS), modificado en las
concentraciones de los macronutrientes, y Woody Plant Medium (WPM) con bajas
concentraciones salinas, aminoácidos, reguladores de crecimiento y vitaminas.El
enraizamiento se ha realizado con éxito en oscuridad, distintos tipos y
concentraciones de auxinas y aclimatación gradual en invernadero. Sin embargo,
los estudios anteriores no han considerado un número suficiente de árboles que
permita evaluar el comportamiento de distintos fenotipos en un proceso de
producción a escala comercial de manera continua.
El
primero en cultivar tejidos vegetales con éxito fue White en 1934, quien logró
cultivar ápices de raíces de tomate en medios enriquecidos con sales, azúcares
y levadura. Demostró además, la sustitución de levadura por tres vitaminas del
grupo B: Tiamina, Piridoxina y Niacina
No
es sino hasta 1934 cuando Gautheret logra proliferación celular in vitro en
tejidos cambiales provenientes de plantas adultas. En 1939 el mismo Gautheret,
Nobecourt (en tejidos de zanahoria) y White (en tejidos de tabaco) publican
casi simultáneamente la formación de una masa de células parenquimatosas
(callo) a partir de los explantes (tejidos) utilizados en sus experimentos.
Este hecho significativo constituye en sí el despegue de las técnicas de
cultivo in vitro.
Un
factor importante en el desarrollo de las técnicas de cultivo de tejidos
vegetales, fue el descubrimiento de los reguladores de crecimiento. Overbeek en
1941 observa el efecto de una sustancia presente en el agua de coco que
estimulaba la división celular (efecto citocinínico). Cuando el agua de coco se
combinaba con 2,4-D, tenía un efecto positivo en el desarrollo de tejidos de
zanahoria y papa (Caplin y Steward 1948, 1952).
VI. MATERIALES Y
MÉTODOS.
La práctica se realizo en el laboratorio de
microbiología del Instituto Tecnológico de Ciudad Altamirano.
6.1
Desinfección de la campana de flujo
Se
encendió la campana de flujo 10 minutos antes de empezar a trabajar se desinfectó
con alcohol al 70% con papel higiénico se deja secar bien para empezar a
trabajar.
6.2
Introducción del material
Se
introdujo el material con el que va a trabajar dentro de la campana de flujo,
los frascos con el medio de cultivo se colocan a un castado, mientras que el
mechero y el frasco donde se colocó las pinzas y los bisturís estériles, se
ponen en el centro de la campana de flujo, las cajas de petri se colocó a un
costado, procurando con esto introducir los materiales por una esquina de la
campana de flujo. Uno de los aspectos mas importantes es la desinfección del
personal que siembra los explantes ya que la persona encargada de sembrar los
explantes debe de lavarse las manos con alcohol al 70%. Esto debe hacerlo cada
vez que saque las manos de la campana de flujo también debe procurar hablar
poco y no meter la cabeza dentro de la campana.
6.3
Desinfestación de los explantes
Se prepara cloralex a un 25% aproximadamente
para desinfestar los explantes. Se colocó 3 partes de agua estéril en un vaso
agregando una cuarta parte de cloralex. Con ayuda de una pinza estéril se
colocan los explantes dentro del frasco preparado con cloralex, se deja por 5
minutos y se agita esporádicamente. Después se retiró el cloralex y se colocó
en un vaso de precipitado de 500ml, se realiza un segundo lavado durante1
minuto con agua estéril. Después de esto se realizó un tercer lavado con agua
estéril durante 5 minutos y se agita esporádicamente el agua que se le va
retirando de cada lavado se va colocando en el vaso de precipitado, una ves
terminado el lavado se retira el vaso de precipitado de la cámara de flujo
junto con los frascos que se utilizaron.
6.4
Corte de los explantes
Una vez desinfestado los explantes se sacó del
frasco y se colocó dentro de caja de petri cuidando de no tocar la parte
interna de la caja de petri con los dedos. Con ayuda de unas pinzas y un
bisturí previamente esterilizados en fuego directo con ayuda del mechero. Se cortó
las partes dañadas por el proceso de desinfestación teniendo cuidado de no
cortar las yemas así también se cortan en partes pequeñas de 1 a 2cm
aproximadamente para sembrarlos en el medio de cultivo.
6.5
Siembra del explante
En este proceso se toma un frasco con medio de
cultivo se quita el sello, tomar con una pinza (previamente esterilizada) el
explante y se coloca dentro del medio de cultivo, esto cuidando que la yema
quede hacia arriba, así también es importante hacer esto cerca del fuego y no
introducir la mano dentro del frasco con el medio de cultivo, es también de
mucha importancia no colocar la tapa boca abajo ni tocar la parte interior de
la misma. Una vez sembrado el explante se cierra fuertemente el frasco y de
esterilizan de nuevo las pinzas para realizar el mismo procedimiento al sembrar
el siguiente explante.
6.6
sellado de los frascos
Una vez sembrado todos los explantes se
realiza el sellado de los frascos, primero se cierra fuertemente con la tapa
para después sellarlos con Parafilm y se colocaron en el estante a la luz del
sol a una temperatura ambiente.
6.7
Lavado del material
Una vez concluida la práctica se realizó el
lavado del material que se utilizo así también se apagó la campana de
flujo.
VII.
RESULTADOS
La
práctica se realizó atendiendo todas las medidas asépticas necesarias, el
material utilizado, fue esterilizado previamente; cada una de las actividades se
realizaron dentro de la campana de flujo laminar para evitar cualquier
contaminación por microorganismos (hongos, bacterias). La campana fue
previamente desinfectada con alcohol y colocó dentro de ella un mechero
encendido.
El
compañero que realizó la siembra del material vegetal, se desinfectó
previamente con jabón y alcohol al 70%, figura 1. El cloro utilizado se preparó
dentro de la cámara de flujo laminar, se
tomó un frasco con 2/3 de agua estéril y agregó 1/3 de cloro, figura 2.
Una vez
que se había preparado el cloro, se prosiguió a la desinfección del material
vegetal, se tomó cada uno de los explantes y se introdujeron al frasco que
contenía el cloro, dejando éstos por 5 minutos, agitándolo en ocasiones; cuando
transcurrió el tiempo, se prosiguió a retirar el cloro de los explantes para
realizar el primer lavado con agua estéril durante 1 minuto; cuando pasó el
tiempo, se retiró el agua y realizó el segundo lavado nuevamente con agua
destilada pero ahora por 5 minutos, por
último se retiró el agua estéril, figura 3.
Fig 3: Desinfección del
material vegetal: a) explantes en cloro, b) agitación de los explantes con
cloro; c) retirando el cloro de los
explantes; d) vertiendo el agua estéril; e) primer lavado; f) retirando el gua
estirl; g) vertiendo agua esteril; h) segundo lavado; i) retirando el agua
estéril; j) explantes desinfestados.
Con los
explantes desinfestados, se prosiguió a realizar el corte de las partes que
quedaron quemadas por el cloro. Se tomó el primer explante con una pinza y se
colocó en una caja de Petri para realizar el corte con un bisturí, para
realizar el corte del segundo explante, se tomó la pinza y el bisturí e
introdujeron a un frasco con alcohol, posteriormente fueron flameadas en el
mechero y así realzó el segundo corte; para realizar los siguientes cortes, las
herramientas fueron esterilizadas en alcohol y flameadas en el mechero. Cada
uno de los explantes ya cortados fueron colocados en la caja de Petri para
realizar la siembra en el medio de cultivo, figura 4.
Fig 4: Corte de los explantes: a) extracción del explante del frasco; b) corte
del explante.
Para realizar la siembra de los explantes, cada uno
de ellos se tomó con una pinza estéril y fueron introducidos a los frascos con
medio de cultivo, estos se colocaron con la yema hacia arriba; cabe mencionar
que para cada siembra la pinza fue esterilizada con alcohol y flameada con el
mechero; cada frasco con el explante fue sellado y colocado en el área de
incubación, figura 5.
Fig 5: Siembra del material vegetal: a) extracción del explante con una pinza
esteril; b) siembra del explante en el medio de cultivo; c) sellado de los
frascos; d) frascos sellados y listos para el área de incubación.
En un máximo
de 72 horas se observan los resultados obtenidos en la práctica, como material
vegetal que está creciendo, contaminado o muerto. Los resultados obtenidos
fueron:
VIII. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
En la práctica se obtuvo un 0% de contaminación en los medios de cultivos;
esto lo redituamos a que la siembra del material vegetal se realizó atendiendo
a todas las medidas asépticas necesarias, ésta se realizó en la campana de
flujo laminar del laboratorio de usos múltiples; aunado a ello, el compañero
que realizó la siembra lo hizo de una manera adecuada, siempre desinfectando
las manos cuando estas salían de la campana de flujo laminar, el material
utilizado como las herramientas fueron correctamente esterilizadas así como el
material vegetal desinfestado.
También se debe el éxito de la práctica a la buena explicación dada por el
profesor encargado Francisco Puche
Acosta, pues de no haber dado una excelente explicación, la práctica
hubiese sido un fracaso.
Es importante que la siembra del material vegetal se realice tomando todas
las medidas asépticas necesarias, pues de esto depende el éxito o fracaso del
crecimiento y desarrollo del material vegetal.
XI BIBLIOGRAFÍA
ü
Sedjo, R.A.1997.El
sector forestal: innovacionesimportantes. Documento de debate97-42. Recursospara el Futuro, Washington
ü Poepp. Et
al,.Embriogénesis somática como alternativa potencial
para la regeneración in vitro del género Nothofagus. UACH. 59–74p.
ü Hoffmann,
A. 1982. Flora Silvestre de Chile. Zona Austral. Fundación Claudio Gay.
Santiago, Chile. Editorial Lord Cochrane. P: 258
ü Gutiérrez,
B. 2000. Áreas productoras de semillas en el mejoramiento genético Instituto
Forestal. P: 215–235.
ü Ipinza,
R., y J. Espejo. 2000. Biología Reproductiva en Nothofagus. Domesticación
y Mejora Genética de Raulí y Roble. Universidad
Austral de Chile/Instituto. Forestal. P:
75–93.
ü Ikemori, Et al. 1994. Integrating biotechnology into Eucalyptus breeding.
Tokio, Japan. P: 77–84.
ü Castellanos et al., 2005.
In vitro propagation of Nothofagus P: 58.
ü Caplin
y Steward 1948, 1952.
ANEXOS
1) Que son los explantes:
R= Los explantes son de diversa naturaleza, pueden ser
porciones de tejido, células sueltas, protoplastos, esporas, granos de polen o
semillas.
2)
Menciona algunos explantes y que crees que se podría
micropopagar con los mismos:
Meristemos
apicales y las yemas axilares (genéticamente
muy estables), sirve para reproducir múltiples clones de una forma o variedad
con características especiales que se desea mantener en el cultivo. Yemas adventicias(genéticamente inestables) producen un alto grado
de variabilidad en los clones, no es útil para la producción de plántulas con
una determinada característica de cultivo, pero sí lo es para el
fitomejoramiento, ya que mediante esta variación semi–natural, es posible
obtener nuevas líneas de cultivo.
3) Una vez que se ha
obtenido el explante, este debe ser correctamente desinfectado. ¿Para qué?
R= para evitar la proliferación de contaminantes
biológicos tales como bacterias, hongos y levaduras principalmente en el medio,
los cuales afectan el crecimiento y desarrollo del explante y por ende compiten con él mismo deteriorándolo y
haciéndolo inservible para cultivo.
4)
A donde son transladados los explantes
desinfectados:
R= son trasladados a una cámara de flujo laminar la
cual proporciona aire filtrado, libre de microorganismos.
5) Que eslo que se
lleva a cabo en la cámara de flujo laminar y en la cámara de crecimiento que
condiciones encontramos para un explante:
R= se lleva a cabo la transferencia a un medio de
cultivo apropiado al tipo de especie y las necesidades del cultivo. Una vez que
el explante está en el medio, se sella el frasco de cultivo y se traslada a una
cámara de crecimiento con condiciones de humedad, temperatura y fotoperiodo
controladas para su desarrollo.
6) Después de algunas
semanas a donde se traslada el cultivo ya que este ha desarrollado algunas
raíces y hojas:
R= se realizael traspaso al invernadero.
