SEP
SNEST
DGEST
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO.
PRÁCTICA NO. 3
“
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO"
MATERIA:
BIOTECNOLOGIA APLICADA
MC. FRANCISCO PUCHE ACOSTA
LOS QUE PRESENTAN:
FLOR DEL CARMEN DORANTES NAVA
ZULAI ESPINOZA AVIANEDA
LUIS ANTONIO FLORES HERNÁNDEZ
FANNY IMELDA PASTENES FELIZOLA
DEYANIRA VERGARA PÉREZ
LICENCIATURA EN BIOLOGÍA
CIUDAD ALTAMIRANO,
GRO. MÉXICO. DEL 2012
PREPARACIÓN DE MEDIOS
PARA EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
RESUMEN
El
presente trabajo se llevó a cabo en el laboratorio de microbiología del
instituto tecnológico de Cd. Altamirano, teniendo como objetivoconocer
la forma de preparación de los medios de Murasshine y Skoog y B5 (o de Gamborg)
para el cultivo de tejidos vegetales. Posteriormente se
prosiguió a pesar las Sales, sacarosa y
phytagelen la
balanza analítica, consecutivamente se agregóa un vaso de precipitado con un
volumen de 500 ml las 6 soluciones previamente preparadas;
posteriormente se agregó la sacarosa disolviendo hasta formar una solución homogénea, seguidamente
se aforó la solución en una probeta de
350ml; inmediatamente se ajustó el pH para posteriormente disolver
el phytagel calentando el medio en una parrilla, para después distribuir el medio
en 9 recipientes de cultivo y finalmente se sellaron los recipientes con el
medio estéril hasta su uso.
Palabras
claves:Medios de Murasshine y Skoo, reactivos, sales, phytagel, balanza analítica,
cultivo de tejidos vegetales.
ABSTRACT
The present work was carried
out in the microbiology laboratory of the Technological Institute of Ciudad
Altamirano, with the objetivoconocer the way of preparing and Skoog media Murasshine
and B5 (Gamborg or) for plant tissue culture. Subsequently continued despite
Salts, sucrose and phytagel en analytical balance, consecutively agregó a beaker with a volume of 500 ml of 6
solutions previously prepared and thereafter dissolving sucrose was added to
form a homogeneous solution, successively gauged the solution in a 350ml beaker
and immediately the pH was adjusted to dissolve the Phytagel subsequently
heating the medium in a grid, and then distributing the medium in culture
vessels 9 and finally sealed containers with the sterile environment until use.
Keywords:Murasshine and Skoo Media, reagents, salts, Phytagel, analytical balance, plant tissue.
I.
ANTECEDENTES
Las primeras experiencias relacionadas con el cultivo de tejidos
vegetales se remontan a 1902, pero recién en 1922 se logró el primer
experimento exitoso: la germinación in vitro de semillas de orquídeas.
Luego de la germinación, las plántulas obtenidas se transfirieron a un medio de
cultivo en condiciones asépticas, y así se mantuvieron protegidas del ataque de
patógenos (hongos, virus y bacterias).
La
ciencia del cultivo de tejidos vegetales debe su origen a la investigación
sobre hormonas quecontrolan el crecimiento y desarrollo vegetal. Este
conocimiento se combinó con las técnicas básicas de microbiología por las
cuales los microorganismos se hacen crecer en medios estériles para la
producción de microorganismos e identificación. Desde estas dos fuentes provino
la tecnología por la cual las plantas u órganos de plantas se pueden
multiplicar en gran número, o su crecimiento individual controlado, haciendo
crecer pequeños trozos de tejido vegetal sobre una receta precisa de nutrientes
en un recipiente estéril.
Actualmente
se ha convertido en una herramienta internacional importante en la selección,
cruzamiento, control de enfermedades y producción en masa de cultivos de
cosecha e involucra diferentes plantas en agricultura, horticultura, forestales
y frutales.
II.
DEFINICIÓN DEL PROBLEMA
Los medios de cultivo son la base para el crecimiento de tejidos
vegetales, estos deben tener los requerimientos orgánicos, inorgánicos y
condiciones o parámetros óptimos, por esta razón es de suma importancia que se realicen
de una manera adecuada, atendiendo a los criterios establecidos, sin dejar a
lado las condiciones asépticas para su elaboración, de ahí el éxito o fracaso
del desarrollo de la planta.
III. OBJETIVO
Conocer la forma de
preparación de los medios de Murasshine y Skoog, B5 (Gamborg) para el cultivo
de tejidos vegetales.
IV
JUSTIFICACIÓN
Las
plantas requieren de ciertos nutrientes para poder desarrollarse y crecer, es
por ello que es de gran importancia conocer cuáles son estos nutrientes que
requiere, así como el saber cómo es que
se preparan estos medios de cultivos. Como biólogos se debe tener conocimiento
de estos datos para poder propagar plantas de buena calidad y en condiciones favorables
y así presentar al público plantas de buena calidad.
V. FUNDAMENTO TEÓRICO
El cultivo in vitro consiste en tomar
una porción de una planta (a la que se denominará explante, como por ej. el
ápice, una hoja o segmento de ella, segmento de tallo, meristemo, embrión,
nudo, semilla, antera, etc.) y colocarla en un medio nutritivo estéril
(usualmente gelificado, semisólido) donde se regenerarán una o muchas plantas,
(Muñoz M. 2006)
La propagación de plantas in vitro es una técnica muy
utilizada en cultivos de importancia económica. Permite cultivar células,
tejidos, órganos, semillas, embriones y obtener individuos selectos en forma
rápida. Los cultivos son realizados por personal especializado en medios
específicos (hormonas, minerales, vitaminas, fuente de carbono, agente
gelificante, agua, etc.) y condiciones ambientales controladas (temperatura,
humedad y luz). Una vez ajustados los protocolos para la especie o cultivo de
interés, es posible automatizar el proceso de modo de llevarlo a mayor escala
de producción, (Barceló et al. 1980)
Es
esencial mantener la esterilidad del medio ambiente confinado en el recipiente,
debido a quecualquier microorganismo que se gane la entrada al mismo crecerá
oportunísticamente a una velocidad mucho más rápida que los tejidos vegetales y
eventualmente colonizarán y matarán a los tejidos, (Pierik,
R.L.M. 1987)
Con
el propósito de sostener el vigor de los tejidos vegetales y permitir que ellos
crezcan, se multipliquen y desarrollen, esto es cultivar los tejidos, deben
darse además ciertos requerimientos externos. Los tejidos pueden necesitar que
se los apoye o sean colocados sobre o en el interior de la superficie de un gel
acuoso solidificado con agar o ellos pueden colocarse en un medio líquido, (Barthelemy R, et al. 1977)
Los cultivos necesitan de un
suministro de los elementos minerales nutritivos que son esenciales para el crecimiento
vegetal, también posiblemente algunas vitaminas, azúcares como fuente de
energía y un cocktail de hormonas vegetales que se conoce que controlan el
crecimiento y desarrollo de estos tejidos particulares. Es conveniente preparar
este medio ambiente nutricional incorporando estos compuestos químicos dentro
del gel o líquido, ajustando el pH alrededor de 6 y esterilizando este medio de
cultivo ya sea dentro del recipiente para cultivo o en uno separado
La formulación del medio cambia según se
quiera obtener un tejido des diferenciado (callo), crecer yemas y raíces, u
obtener embriones somáticos para producir semillas artificiales, ver tabla 1.
Tabla 1.
Composición de medios de cultivo para células vegetales
VI.
MATERIALES Y MÉTODOS
6.1
Preparación de medios de cultivos (MS)
Se
tomó un vaso de precipitados con 100 ml. De agua destilada al cual se le agrego
las 6 soluciones antes preparadas haciendo uso de una pipeta, las soluciones
fueron agregadas de una manera ordenada para no repetir la misa solución. El
orden se colocó de la siguiente manera:
1.-
Nitratos
2.-
Sulfatos
3.-
Quelatos
4.-PoBoMo
5.-
Alógenos
6.- Orgánicos
Al
tener mezcladas todas las soluciones en el vaso de precipitados, se agregó
10.5g de sacarosa, ésta tiene que estar bien disuelta, por tal motivo se tuvo
en constante movimiento hasta tener una
solución homogénea.
Teniendo
ya una solución homogénea se vació a una probeta graduada y aforaró a 350 ml.
Se tiene que tomar muy en cuenta no pasarse del volumen ya mencionado, puesto
que no se tendría los resultados requeridos.
6.2 Medición del pH
Para
poder medir el pH se vació la solución nuevamente a un vaso de precipitados, se
midió el pH con un potenciómetro. Si se obtiene un pH bajo se le aplica 0.1N o
bien 0.01N (por gotas) de NaOH para subir el pH. Por el contrario si el pH es
elevado se le aplica 0.1 N o bien 0.01 N de HCL para bajar el pH. El rango que
se tiene para el pH adecuado es de 5.7 a 6.0).
6.3 vaciado de Phytagel
Al
tener la solución con el pH adecuado se colocó en una parrilla eléctrica.
Cuando la solución alcanzó una temperatura de 50 a 70 °C se vació poco a poco
1.05 de phytagel y se agitó constantemente para poder tener una solución
homogénea, además para que el phytagel no se engrumara. Una vez que la solución
teniatoos los componentes necesarios y requeridos, se dejó bullir por dos
minutos. Transcurrido el tiempo, la solución del cultivo, se dejó a ambiente
para posteriormente vaciar 25ml aproximadamente en 15 frascos con tapa rosca.
Posteriormente se dejó enfriar la solución en los frascos, para poder
sellarlos. Al tener los frascos serrados y sellados se metieron al congelador
de un refrigerador.
VII. RESULTADOS
Lo
primero que se realizo fue poner en forma ordenada todas las soluciones que se
utilizarían para preparar el medio de cultivo Murasshine y Skoog en la mesa del
laboratorio con una pipeta exclusiva para cada solución. El orden fue el siguiente:
·
Nitratos
·
Sulfatos
·
Quelatos
·
Solución de Po Bo Mo
·
Halógenos
·
Orgánicos
Para iniciar, se tomó 3.5ml de cada una de
las soluciones stock antes preparadas, haciendo uso de una pipeta para cada
solución.
Cabe señalar que una gran ventaja es que
todas las soluciones estaban a una concentración de 100X lo que facilito el
cálculo para agregarlo a nuestro medio de cultivo.
Por otro lado se pesó 10.5g de sacarosa y
1.05g de phytagel en una balanza analítica, haciendo uso de papel aluminio para
su pesado exacto y preciso. Una vez que el vaso de precipitado contenía las 6
soluciones stock, se prosiguió a disolver la cantidad de sacarosa.
Sacarosa
Phytagel
Se disolvió la sacarosa en 100 ml de agua en
un vaso de precipitado con las 6 soluciones stock.
Después de esto se diluyeron bien todas las
soluciones agregadas junto con la sacarosa y se afora a 350ml en una probeta
con agua de garrafón, debido a la falta de agua destilada como tal.
Cuando se ha realizado el aforado la solución
se vuelve a verter en el vaso de precipitado para medir el pH con el
potenciómetro.
Para
subir el pH se agregó Na OH gota a gota hasta llegar al pH deseado que era de un
rango de 5.7 a 6.0.
Después
de haber obtenido el pH deseado se calienta la solución a 50-70°C y se agrega
el Phytagel poco a poco hasta que se haya diluido completamente, cunado la
solución empiece a hervir se deja 1 o 2 minutos y después se apaga.
Se agrega la solución en los frascos previamente marcados para
identificarlos. Se agregan aproximadamente 25ml a cada uno de los frascos con
ayuda de un frasco modelo lleno de agua para tomar la medida aproximada de 25ml
para llenar los otros frascos con la solución.
Por último se sellaron los frascos y se guardaron en el refrigerador.
VIII. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
8.1
Conclusiones
Se logró preparar 350 ml de medio M. S partiendo de
soluciones stock de sales y orgánicos con una concentración de 100X exitosamente, añadiendo
30 g/l de sacarosa, 3 g/l de phytagel. Una vez que se obtuvo el medio M.S con
la concentración correspondiente de cada uno de los ingredientes, se tuvo un
pequeño inconveniente con respecto al ajuste de pH ya que este estuvo por
debajo del rango adecuado, pero posteriormente se le agrego NaOH para ajustar
el pH al rango adecuado una vez que se logró ajustar el pH se aforo en una
probeta de 350 ml para posteriormente ser nuevamente vertido al vaso de
precipitado y poder agregarle el phytagel y agitarlo, con una temperatura
de 50-70 ° c una vez que se enfrió un poco se vertió en cada
uno de los frascos previamente esterilizados, para ser introducidos en refrigerador
y poder usarlos en la siembra de vegetales.
Con esta práctica se
logró que el alumno aprendiera a preparar medios para el cultivo de vegetales, así
como la importancia que tienen cada uno de los componentes en el medio de
cultivo y lo que ocasiona si nuestra solución no está concentrada en los
parámetros establecidos para el cultivo de tejidos vegetales, esto es de suma
importancia ya que de esto va a depender si nuestro tejido vegetal se desarrolle
en nuestro medio in vitro de forma viable.
8.2 Recomendaciones
Se
recomienda que se pesen adecuadamente cada uno de los ingredientes que
contendrá el medio de cultivo ya que un
error cambia en gran medida la concentración de nuestra solución, así también
se recomienda a los alumnos llevar acabo todos pasos necesarios y revisar el
formato de la práctica, pedir ayuda al profesor en caso de tener alguna duda en
alguno de los pasos que se especifican en la práctica, es importante que cuando
se le agrege el phytagel se esté agite constantemente para evitar que se forme
algún grumo que pueda dañar nuestra solución o medio de cultivo esto es en caso
de que en el laboratorio no se cuente con suficientes pastillas magnéticas y
con el material necesario
IX. FUENTES
CONSULTADAS
Barceló et al. (1980) Fisiología vegetal. Editorial Pirámide Barthelemy R, Dawson J, Lee A (1977) Técnicas para el laboratorio
de biología. Compañía Editorial Continental Muñoz de Malajovich, M. A. (2006) Biotecnología. Editorial
Universidad Nacional de Quilmes Pierik, R.L.M. (1987) In vitro culture
of higher plants. Editorial
MartinusNijhoffPublishers
ANEXOS
1.
¿Qué es un medio de cultivo?
R= formulación químicamente definida, donde los explantes
(plantas) encuentran las condiciones para desarrollar su potencial intrínseco.
2.
¿Cuáles son los compuestos orgánicos para los medios de
cultivo?
ü Carbohidratos
ü Vitaminas
ü Aminoácidos
ü Reguladores de crecimiento.
3. ¿Cuáles son los
componentes inorgánicos necesarios para los medios de cultivo?
ü Macroelemnetos(N,P,K,A,Mg,S)
ü Microelementos (Fe,SoZn,Ni,B, Al,Mn, Mo, Cu,I)
4.
¿Por qué consideras importante los medios de cultivo?
R= porque sirven para propagar tejidos vegetales, en el
laboratorio de biotecnología
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