2.1 MEDIOS DE CULTIVO

2.1.1 AREAS DE LABORATORION DEL CULTIVO DE TEJIDOS

LABORATORIO

En el laboratorio se encuentran las áreas especializadas para realizar o llevar a cabo el cultivo de tejido de vegetales, así mismo tiene la función de contar con materiales disponibles para llevar a cabo las prácticas, también cuenta con áreas donde el estudiante guarde pertenencias, sentarse a descansar, etc. y baños. Las áreas que posee se mencionan en este apartado:

*ÁREA DE RECEPCIÓN.  ÁREA NEGRA 

   FUNCIÓN: que el estudiante se cambie de ropa, guarde pertenencias, sentarse a descansar un rato o bien con una computadora portátil, esta área comúnmente contiene baños, mesas, sillas o escritorio.

   MATERIAL: mesas, sillas, escritorios para computadoras, etc.

* ÁREA DE REACTIVOS

      FUNCIÓN: es un área o gabinete donde se guardan las sales y otros reactivos que se usaran para la elaboración de los cultivos vegetales.

*ÁREA DE LAVADO: colocada fuera del área de preparación de cultivo de tejido vegetal.

   FUNCIÓN: la función principal de esta área, es para uso exclusivo de lavado de materiales ya utilizados, lavado de explantes cundo vienen del exterior, así como también lavado de manos para una buena asepsia, compuesto por un fregadero, abundante agua y estantes de secado.

   MATERIAL:  fregaderos con agua corriente (caliente o fría), destilizador de vidrio o de material no toxico, desionizador de agua entre el destilador y el lavadero, agua destilada en botellas de plástico, cestos para cada tipo de  basura orgánica, inorgánica y vidrio que se deseche, gradillas para secado, bandejas de aluminio y de plástico de varios tamaños, recipientes de plástico grande.

   EQUIPO: tuberías de agua (caliente o fría).

*ÁREA DE ESTERILIZACIÓN:

   FUNCIÓN: es el área donde se realiza la destrucción total de microorganismos viables presentes en cultivos preparados y envasados, son esterilizados en un autoclave, esta en un área separada del área de lavado. Cabe mencionar que los autoclaves pueden ser horizontales y verticales o pequeños. 

   MATERIAL: autoclave manual u automático (olla de presión), estufas para esterilización, área de secado.

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*AREA DE PREPARACION DE MEDIOS, S/MUCHA ASEPSIA.  ÁREA GRIS

   FUNCIÓN: su principal función es llevar a cabo la preparación de los medios de cultivos, es un área espaciosa con suficientes mesas para la preparación de los medios, contiene puertas separándola de otras áreas. En esta área se encuentran espacios donde se almacena el material de cristalería (vidrio, plástico y los reactivos) necesarios para hacer las diluciones y aforos (matraces, vasos de precipitado, botellas de vidrio, probetas, pipetas, etc)  y además contiene balanzas granatarias y de precisión, medidores de pH, parrillas de calentamiento, etc. esta área contiene climatización

   MATERIAL: material de vidrio e instrumentos: pipetas, mechero, matraces vasos de precipitado, probetas, pipetas, frascos Erlenmeyer, balanzas, granatarias y de precisión, potenciómetro, mesa de trabajo, bancos, medidor de pH, destilador de plástico, frascos de vidrio  (125, 250 y 500 ml), botellas, mascara, guantes, pinzas, cajas de Petri, agua destilada, reactivos, vitrinas, estanterías, espacios para el refrigerador, la cámara de crecimiento e incubadora, cámara de flujo laminar, áreas para almacenamiento, baños u oficina,

   EQUIPO: balanza (macrobalanzas y una precisión) productos químicos, plancha eléctrica con agitador, agitador magnético y platos calientes con agitador, refrigerador, incubadora, cámara de crecimiento, vitrinas, tuberías para agua corriente, gas, aire acondicionado, área de lavado, y parrillas de calentamiento.

* ÁREA DE TRANSFERENCIA (CAMARA DE CULTIVO, ÁREA DE SIEMBRA  E INOCULACIÓN)    ÁREA BLANCA.

   FUNCIÓN: se realiza el trabajo de excisión, inoculación y transferencia de los explantes a los medio de cultivo. Debe contener los más altos niveles de limpieza ambiental (ASEPSIA), encontramos cámaras de siembra o campanas que proporcionan flujo de aire estéril para hacer la trasferencia aséptica del explante al medio de cultivo. Es recomendable la  instalación  de gabinetes de flujo horizontal o vertical de aire filtrado bajo presión o la construcción de cuartos de transferencia, o se puede realizar ciertas operaciones de inoculación, como la excisión y el cultivo de ápices y meristemos en tubos de ensaye de boca angosta, en mesas limpias libre de corriente de aire y polvo, por consiguiente debe contener un suministro de gas, luz y sobre todo aire acondicionado.

   MATERIAL: instrumentos de disección: cuchillas, mangos para cuchillas, aguja de disección,  pinzas, tijeras, navaja de afeitar, tubos de ensaye, frascos de alcohol, mascas, guantes, marcadores aprueba de agua, bandejas y tambos para basura.

  EQUIPO: cámaras de siembra (o campanas) gabinetes de flujo laminar, microscopios (estereoscópico, compuesto, de disección incidente, invertido entre otros), tuberías de gas, luz eléctrica y aire acondicionado.

  Figura 1. Delimitación y siembra del ápice meristematico.

* ÁREA DE CRECIMIENTO (CUARTO ESTERIL O INCUBACIÓN,)  ÁREA BLANCA

   FUNCIÓN:  es un área donde llevaremos acabo los medios sembrados con los explantes para el crecimiento e incubación de los tejidos vegetales en un cuarto o gabinetes o bien cámaras de crecimiento, proporcionar un buen control de temperatura optima (20-30°C), una buena distribución del aire e iluminación variable según las necesidades como la luz blanca fluorescente (1000 a 5000 lux) y humedad relativa (70%-80%)  esta área debe estar totalmente aséptica, con iluminación, temperatura y sobre todo humedad relativa controlada, debe contener estanterías metálicas o madera para colocación de cultivos; así mismo deberá contener un espacio para cultivos en agitador y para cultivos estanticos en oscuridad.

   MATERIAL: lámparas, estanterías (anaqueles, metálicas o de madera), bandejas, termómetros (de máxima y mínima), gradillas para tubos (varios tamaños), macetas suelo y bandejas.

     EQUIPO: cámaras de alta humedad, climatizador (aire acondicionado), lámparas con luz fluorescente, alarmas, controles (para cortar la iluminación por falla de aire acondicionado) y microscopios (estereoscópico, compuesto, invertido entre otros).   

Figura 2. Cuarto de crecimiento in vitro.

*ÁREA DE OBSERVACIÓN Y EXAMINACIÓN

   FUNCIÓN: la función principal de esta área es llevar acabo las observaciones periódicas de  los tejidos vegetales y evaluar el estado de los cultivos. En esta área se colocan los microscopios que también pueden ser colocados en el área de incubación o de transferencia, así como estas y otras áreas forman el núcleo central del laboratorio de cultivos vegetales,

   MATERIAL: medios solidos y líquidos

   EQIPO: Microscopio estereoscópico, microscopio compuesto, lentes de aumentos, y elementos ópticos complementario

Figura 3. Observación y examinación  del cultivo de tejido

*ÁREA DE RUSTICACIÓN (ÁREA ACLIMATACIÓN O ADAPTACIÓN O ENDURECIMIENTO)

   FUNCIÓN: esta área esta fuera del laboratorio, su principal función es endurecer las plantitas que se van a producir en in vitro, esto con la posibilidad de controlar la luz y la humedad, para que las plantitas se desarrollen en un ambiente natural.

   MATERIAL: malla, tubos para soporte de la malla, terreno para colocación de la casa malla, bolsas de plástico negro p/ siembra, suelo.

   EQUIPO: sistema de riego.

	Figura 4. Vitroplantas en aclimatador ex vitro.

2.1.2 MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO

Dentro de la gama de materiales de laboratorio encontramos muchos artefactos que se utilizan para el cultivo de tejidos vegetales, estos materiales puede estar fabricados con vidrio, plástico, metal, porcelana, madera, goma u otros componentes, dentro de ellos están los siguientes materiales y equipos:

1.    Área de lavado y esterilización: autoclave manual u automático (grande o de mesa), destilador de vidrio, gradillas para secado, bandejas de aluminio y de plástico (varios tamaños), recipientes de plástico grandes, estufa para esterilización y secado.

2.    Área de preparación: refrigerador, balanzas (macrobalanza y una de precisión), potenciómetro, plancha eléctrica con agitador, magnético, frascos Erlenmeyer, botellas de vidrio o plástico.

3.    Área de transferencia: gabinete de flujo laminar, microscopio de disección con luz incidente e instrumentos de disección: cuchillas no.10 y no.11, mangos para cuchillas, agujas de disección, pinzas tijeras, navajas de afeitar. También frascos de alcohol, mechero de alcohol, mascaras guantes, marcadores a prueba de agua, bandejas y cesto para basura.

  

4.    Área de incubación (cuarto estéril, área de crecimiento): un cuarto con temperatura, iluminación y humedad relativa controladas; estanterías con iluminación parta los cultivos, termómetros de máxima y mínima y gradillas para tubos de vario tamaños, macetas suelo, bandejas y cámaras de alta humedad.

5.    Área de observación y examinación: microscopios estereoscopio, microscopio compuesto, lentes de aumento, y elementos ópticos complementarios.

6.    Área rusticación (área aclimatación o adaptación o endurecimiento): casa malla y sistema e riego adecuado para mantener las plantas viables.

BIBLIOGRAFIA

   Cultivo IN Vitro y su Relación con la Biotecnología

   www.argenbio.org/adc/.../Cultivos%20celulares%20II%20Euge.pdf.  07:00pm 08/02/12

   CULTIVO DE TEJIDO VEGETAL

   Exa.unne.edu.ar/biología/fisiología. Vegetal/ cultivo de tejidos. Pdf. 07:39 08/02/2012

   ROCA. W.M y MROGINSKI. L.A. Principios Básicos, Metodologías y Técnicas del Cultivo de Tejidos Vegetales. Pdf. Cap.1 pág. 1-18.